微生物学

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医学検査の専門家
医師の指示監督のもと、病院や診療所などで、微生物的検査や血液学的検査、病理学的検査、心電図、脳波検査などの生理学的検査などさまざまな検査を行い、診断や治療の基礎となるデータを提供する。検査結果が医師の診断を大きく左右するので、緻密な作業が要求される。
『大学・短大・専門学校・スクール』進路情報多数掲載


■ 測定原理
▽ Taqman MTB - 結核菌群DNAの16SrRNA領域をターゲットにDNAの臓腑とサイクルを繰り返しながらPCR産物をリアルタイムモニターすることで検出する。

▽ Taqman MAI - M.avium 、 M.intracellulare に共通の16SrRNA領域をターゲットにしたプライマーと菌種それぞれに特異的な蛍光標識 DNA プローブを用いて検出する。


■ おもな使用器具および試薬

▽溶菌試液用添加剤 SOL-L   ▽中和試液用添加剤 SOL-N  ▽アンプリミックス


.アシストチューブアシストチューブ.........
.トランスファーピペット .トランスファーピペット........
KチューブK チューブ



■ PCR測定順序

1.前処理した検体をボルテックス(混和)して1000 rpm 1分間遠心する。
2.アシストチューブにオリゴテックス入りバッファー(洗浄液)を500μℓ ずつ分注する。
3.遠心した検体を100μℓ ずつ加えてボルテックスしたら 13000rpm 10分間遠心
4.TB用とMAC用のKキャリアにKチューブをそれぞれセット、TBとMACのアンプリミックスを50μℓずつ分注し遮光する。
 マスターミックスと内部コントロールを混和したものをアンプリミックスとする。
5.アシストチューブの遠心が終わったらトランスファーピペットで上清を除去し塊だけが残るようにする。
6.SOL-L 試薬を100μℓ ずつ加える この時 TB(+) と 陰性 、M.avium 、 M.intracellulare のコントロールそれぞれを 20μℓ とSOL-L 試薬を80μℓ ずつ加えてコントロールを作成する。
7.よくボルテックスして塊(ペレット)をなくしてスピンダウンしたら 60℃10分間インキュベート(恒温)する。
8.恒温槽から検体を取り出してスピンダウンしたらSOL-N 試薬を100μℓ ずつ加える。
9.よくボルテックスしたら 13000rpm 2分間遠心する。
10.遮光してあった Kチューブに検体の上清を50μℓ ずつ分注(ピペッティング3回以上)して蓋を閉じたらコバスTaqManにセットする。


コバスTaqMan
■PCR測定器の能力
ブリサイクル:50℃300秒
サイクル1~2:98℃20秒、61℃40秒、70℃20秒
サイクル3~55:95℃25秒、61℃25秒、70℃20秒
ポストサイクル:40℃120秒
M.avium 用DNAプローブ:520nm
M.intracellulare 用DNAプローブ:575nm
内部コントロール用DNAプローブ:715nm


■検査結果の判定

▽誤判定要因: 多量の血液混入、喀痰の膿性が少ない、前処理が不完全で菌量が極端に多い または少ないなど

抗酸菌PCR判定表

いずれかの測定結果が Invalid であった場合は再検に回す。
サイクル値42あたりで1回目が陽性、2回目が陰性だった場合はカットオフ値近辺とする。

引用: 【機器全般】ロシュ、 【試薬】島津製作所 {友達が研究員として在籍してます。



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■ 抗酸菌の検体 - 検査材料

主に喀痰が抗酸菌の検査材料として採取されるが、胸水、髄液、胃液、尿など無菌的な部分からそうでないところまで、体内のあらゆる場所から採取される。また、喀痰はMiller&Jonesで M1~P3まで膿性の度合いで分類され膿性部分が 1/3 以上ある検体の検査結果でないと十分な信頼性が得られないとされている。


■ 抗酸菌の分類 - Runyon分類

抗酸菌は結核菌群と非結核菌群に分類され、さらに非結核菌群はⅠ~Ⅲ群を遅発育菌とし、Ⅳ群を迅速発育菌と分類される。 結核菌群で有名なものに、人型結核の M.tuberculosis やウシ型結核の M. bovis があり、感染力が高いので安全キャビネット内で操作し、取り扱いには細心の注意を払う必要がある。


Ⅰ群:光発色菌  - M. kansasii
Ⅱ群:暗発色菌  - M. marinum 表在菌  M. gordonae 環境菌
Ⅲ群:非発色菌  - M. avium と M. intracellulare は、MACと称される
Ⅳ群:迅速発育菌- M. fortuitum


抗酸菌検査手順

・培地には液体培地のMGIT、固形培地の小川があり抗酸菌の発育の判定には液体培地は6週間、固形培地は8週間培養して様子をみる。
.・培養後の塗抹にて雑菌しかみられなかった場合には、スプータによる雑菌処理を行う。
・抗酸菌の同定には抗酸菌薬剤感受性検査(MIC)や抗酸菌群核酸同定検査(DDH)などがおこなわれる。

■ 抗酸菌の前処理 - NALC-NaOH処理

抗酸菌の検査を進めるにあたって重要となってくるのが、雑菌の処理である。検体を何も処理しないまま培養しても雑菌の繁殖により抗酸菌の発育が抑制されてしまう可能性が高いのでNALC処理が必要となってくる。材料が喀痰のような粘性が高い検体には、NALC (N-acetyl-L-cysteine)の還元作用により喀痰をサラサラな状態に変化させることで NaOH(殺菌)の浸透を促す作用がある。最後にNaOHはアルカリ性であるので中和にリン酸緩衝液で中和し 3000rpm 15分遠心して集菌をおこなう。


■ 抗酸菌染色 ― チールネルゼン染色 蛍光染色

抗酸菌PCR検査の前や培養後の抗酸菌の確認などに抗酸菌を染色し鏡検することで判断材料の一部となる。 抗酸菌染色には検体に菌がどれぐらい存在するのか定量的に分析するチールネルゼン染色と菌の有無を確かめ定性的に分析する蛍光染色に分かれる。前者のチールネルゼン染色では石炭酸フクシンで抗酸菌を赤く、メチレン青で雑菌を青く染め1000倍の顕微鏡で鏡検してガフキ―号数で抗酸菌の量をあらわす。後者の蛍光染色ではローダミンとオーラミンにより抗酸菌を発色させ200倍の蛍光顕微鏡で鏡検する。


チールネルゼン染色
1.検体をスライドガラスに塗抹しホットプレートで100℃10分固定する。

2.検体を塗抹したスライドガラスに石炭酸フクシンを滴加し、アルコールランプで炙り 10分間放置する。

3.スライドガラスに滴加した石炭酸フクシンを捨て水洗する。................................

4.塩酸アルコールを滴加し5分間放置(3回繰り返し計15分間脱色する)

5.よく水洗したあとメチレン青を滴加して5分間放置

6.よく水洗したあとドライヤーで乾燥させる。


蛍光染色
1.検体をスライドガラスに塗抹しホットプレートで100℃10分固定する。

2.検体を塗抹したスライドガラスにローダミンを滴加し、1分間放置する。

3.スライドガラスに滴加したローダミンを捨て、その上からオーラミンを滴加し10分放置する。

4.スライド上の染色液を捨て水洗する。

5.塩酸アルコールを滴加し5分間放置(2回繰り返し計10分間脱色する)

6.よく水洗したあとメチレン青を滴加して5分間放置

7.よく水洗したあとドライヤーで乾燥させる。
チールネルゼン染色 蛍光染色


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